2019, 29(8):50-54.DOI: 10.3969/j. issn. 1671 -7856. 2019. 08. 008
摘要:目的 建立成年狨猴肾脏细胞体外培养的培养体系,并将Cas9 编辑系统初步应用于所培养的狨猴肾脏细胞,建立检测sgRNA 切割活性的体系?方法 取成年的狨猴肾脏,采用贴壁法?消化法得到狨猴肾脏细胞?对细胞进行生长曲线测定?转染试剂(Viafect 和Lipo2000)及抗性(嘌呤霉素和杀稻瘟菌素)浓度筛选,将SIRT1 的sgRNA 质粒和Cas9 质粒共转染狨猴细胞,提取基因组并对基因修饰目的片段扩增,并将扩增产物进行测序?结果建立狨猴肾脏细胞体外培养体系;ViaFect 转染试剂转染率大于60%;细胞抗性筛选适宜浓度嘌呤霉素4 μg/ mL,杀稻瘟菌素8 μg/ mL;测序结果表明,从sgRNA 的PAM 序列附近开始出现突变峰,证明sgRNA 成功引入突变?结论 成功建立了狨猴肾脏细胞的体外培养?细胞转染和抗性筛选体系;CRISPR/ Cas9 可以用于狨猴肾脏细胞编辑,为基因修饰狨猴靶点选择提供依据?
2018, 28(6):15-20.DOI: 10.3969/j. issn. 1671 -7856. 2018. 06. 004
摘要:目的 筛选?优化狨猴微卫星DNA 引物,用以对中国医学科学院医学实验动物研究所引进的实验用狨猴种群进行遗传学分析及评估?方法 用筛选的20 对狨猴微卫星引物,对随机抽取的30 只狨猴血液样本进行基因组DNA 提取及PCR 扩增,扩增产物经电泳鉴定后进行STR 扫描检测,用Popgene1.32 软件对STR 扫描结果进行数据处理和分析?结果 20 对微卫星引物均呈现出遗传多样性,共检测147 个等位基因,观察等位基因数5~10 个,平均7.35 个;有效等位基因数2.2500 ~ 6.3830 个,平均4.0402 个;观察杂合度0.000 ~ 0.4667,平均0.1533;期望杂合度0.1424 ~0.4350,平均0.2506;香隆指数1. 2242 ~2.0324,平均1.5949;多态信息含量0.5366 ~0.8254,平均0.7053?结论 本文筛选的20 对狨猴微卫星引物具有高度遗传多样性,均处于Hardy?Weinberg 平衡状态?
2018, 28(8):38-42.DOI: 10.3969/j. issn. 1671 -7856. 2018. 08. 008
摘要:目的 应用核酸检测技术检测小鼠盲肠内容物中MHV?Reo?3?MNV 三种肠道病毒,并与血清学检测结果相比较,分析核酸检测在小鼠健康监测中的适用性?方法 随机选取本实验室接收的小鼠盲肠内容物样品,提取核酸,应用荧光定量PCR 技术检测MHV?Reo?3?MNV 三种肠道病毒;并与其血清学抗体检测结果做关联分析?结果 在272 份样品中,MHV?Reo?3?MNV 三种肠道病毒检出率分别为17. 3%,18. 8%,16. 9%;MHV?Reo?3核酸检出量多呈低拷贝状态;与血清学抗体检测结果的关联分析表明3 种病毒的核酸检测结果与抗体检测结果不完全相关?结论 实验动物小鼠群体中存在携带MHV,Reo?3,MNV 三种病毒的可能,作为血清学抗体检测技术的补充,核酸检测可作为高敏感性的方法应用于实验动物群体的健康监测?
2018, 28(4):98-102.DOI: 10.3969/j. issn. 1671 -7856. 2018. 04. 017
摘要:目的 分析实验动物小鼠三种肠道病毒MHV?Reo-3?MNV 生物样品的储运条件对病原核酸检测结果的影响?方法 将MHV?Reo-3?MNV 三种RNA 病毒与小鼠盲肠内容物混合制备参考品;保存剂包括RNA 提取试剂裂解液(BufferAVL)及生理盐水,存储温度为4℃及室温(22℃~ 25℃);在保存1?2?3?7?14 d 时间点提取各样品核酸,采用实时荧光定量PCR 方法检测病毒样品量的变化?结果 生理盐水作为保存剂核酸样品检出量低于RNA 提取试剂裂解液组,且检出量下降明显;Buffer AVL 组样品储于4℃条件的样品检出量优于室温25℃的条件;4℃-buffer AVL 组的三种病毒参考品在3 d 时间点的病毒检出量在50%以上,在7 d 时间点仍有检出,但14 d 时已检测不到?结论 三种小鼠RNA 病毒样品储运条件优选使用RNA 提取试剂裂解液,并在低温条件下储运,最好在3 d 内完成核酸检测?
2018, 28(6):101-105.DOI: 10.3969/j. issn. 1671 -7856. 2018. 06. 018
摘要:目的 狨猴血清中纯化IgG 抗体,制备兔抗狨猴抗血清,并纯化抗血清中IgG,HRP(辣根过氧化物酶)标记兔抗狨猴IgG?方法 HiTrap TM Protein G 亲和层析纯化狨猴和兔抗狨猴血清IgG,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS?PAGE)进行纯度鉴定,免疫琼脂双扩散法(double immunodiffusion assay)测定制备的兔抗狨猴抗血清效价,改良“简易过碘酸钠标记法”制备兔抗狨猴IgG?HRP 标记抗体,酶联免疫吸附测定法(ELISA)及蛋白免疫印迹法(Western blotting)对兔抗狨猴IgG?HRP 标记抗体进行工作浓度测定及特异性鉴定?结果 狨猴和兔抗狨猴血清纯化IgG 纯度分别大于95%?97%;兔抗狨猴IgG 抗血清的效价为1∶ 64?ELISA 和Western blotting 鉴定了兔抗狨猴IgG?HRP 酶标抗体参考工作浓度为1∶ 256 000?1∶ 15 000,特异性明显?结论 制备狨猴IgG?HRP 标记抗体并初步鉴定,包括ELISA 及Western blotting 的特异性及使用浓度,为狨猴病原体免疫学检测体系及分子免疫学检测体系储备了资源?